限制性內(nèi)切酶脾氣很大，遇到「不開(kāi)心的事兒」她就會(huì)罷工。同樣地，當(dāng)限制性內(nèi)切酶遇到了甲基化的質(zhì)粒，她也就這樣悄無(wú)聲息地罷工了，留下實(shí)驗(yàn)失敗的你獨(dú)自流淚。

甲基化是細(xì)菌用來(lái)保護(hù)自己的基因序列不被自身合成的限制性內(nèi)切酶所切割，是細(xì)菌的一種自我保護(hù)機(jī)制。常見(jiàn)的甲基化包括了 Dam+、Dcm+、EcoKI+、EcoBI+ 以及真核細(xì)胞中的 CpG 等。同理，不同的甲基化也能夠識(shí)別特定的序列，從而在特定的堿基上進(jìn)行。如果當(dāng)限制性內(nèi)切酶所識(shí)別的序列與甲基化識(shí)別的序列相同或者重疊時(shí)，限制性內(nèi)切酶將不能夠切開(kāi)該位點(diǎn)序列（見(jiàn)表二）。另外，還需注意一點(diǎn)，我們實(shí)驗(yàn)所采用的大腸桿菌是否是屬于上述甲基化的陽(yáng)性菌株，如果是，恭喜你，實(shí)驗(yàn)失敗很正常，懵逼樹下的懵逼果等你去嘗嘗。所以，快去看看你所用的限制性內(nèi)切酶是否和甲基化的識(shí)別序列重合，你的克隆菌株是否是甲基化的陽(yáng)性菌株吧。

不用酶切，PCR 也可以幫你完成分子克�。�

1、反式 PCR

我們都知道，在做分子克隆的時(shí)候，必須要用限制性內(nèi)切酶將環(huán)狀質(zhì)粒切割成為線性，才能夠連接我們的目的片段。那么，大家有沒(méi)有想過(guò)，在我們的酶切位點(diǎn)兩頭，以質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)引物，反向直接擴(kuò)增我們的質(zhì)粒呢？這樣的質(zhì)粒天生就是線性化的質(zhì)粒，而且無(wú)需進(jìn)行搖菌培養(yǎng)質(zhì)粒提取和酶切等復(fù)雜的操作。這就是我們所說(shuō)的反式 PCR。是不是很簡(jiǎn)單？對(duì)，就是這么簡(jiǎn)單到你懷疑人生。但有一個(gè)問(wèn)題來(lái)了，整個(gè)反應(yīng)體系中的模板即我們?cè)瓉?lái)的環(huán)狀質(zhì)粒，如果在進(jìn)行克隆連接的時(shí)候豈不是也被導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中表達(dá)，也就是說(shuō)我們挑菌的時(shí)候也是有概率會(huì)挑到這些空載載體的！如何解決？接著看就明白了。

2、DpnI 切割反式 PCR 中的環(huán)狀質(zhì)粒

之前小編在甲基化中提到過(guò)，我們還有一個(gè)特殊的限制性內(nèi)切酶沒(méi)有提到，它就是 DpnI。這個(gè)酶之所以特殊，其原因在于它不同于其他的限制性內(nèi)切酶，它只有當(dāng)存在 GATC 序列被甲基化的時(shí)候才能夠發(fā)揮它的活性，進(jìn)行完全的切割，也就是說(shuō)它和其他受到甲基化影響的酶是相反的。甲基化只有在甲基化陽(yáng)性的原核或者真核生物中才能夠存在。所以，當(dāng)我們用 Dam+菌株提取的質(zhì)粒進(jìn)行反式 PCR 的時(shí)候，為了降低后期克隆實(shí)驗(yàn)的空載率，我們需要使用 DpnI 來(lái)消化我們?cè)瓉?lái)用于模板擴(kuò)增的環(huán)狀質(zhì)粒，由于質(zhì)粒上存在多個(gè) GATC 甲基化的序列，因此，DpnI 能夠?qū)⒃瓉?lái)環(huán)狀質(zhì)粒直接切割成多條片段，另外，PCR 擴(kuò)增的線性質(zhì)粒并沒(méi)有在原核生物體內(nèi)進(jìn)行過(guò)甲基化，因此線性質(zhì)粒的序列不會(huì)被 DpnI 識(shí)別切割，從而達(dá)到我們分離環(huán)狀質(zhì)粒和線性質(zhì)粒的需求。這里需要提醒下小伙伴們，如果你們的質(zhì)粒模板是從 Dam-菌株里面提取的，那么以上的方法就不再適用了！至于原因，大家可以想一想，小編就不在這里贅述了。

關(guān)于限制性內(nèi)切酶，目前已經(jīng)商業(yè)化的品種已經(jīng)兩百多種，作為目前世界排名靠前的內(nèi)切酶生產(chǎn)商，莫納生物對(duì)這類基礎(chǔ)工具酶已經(jīng)研究探索多年，為了打破國(guó)外四十多年的壟斷地位，繞過(guò)國(guó)際專利保護(hù)，莫納生物自主研發(fā)了全新的內(nèi)切酶生產(chǎn)工藝，目前在售的快速內(nèi)切酶已經(jīng)四十多種（持續(xù)增長(zhǎng)中），現(xiàn)階段已經(jīng)基本滿足常規(guī)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)需求。

都 9102 年了，你還在用傳統(tǒng)的方法做克��？

克隆虐我千百遍，我待克隆如初戀。做個(gè)克隆，至少需要兩天的時(shí)間，還要忙前忙后準(zhǔn)備一大堆需要的東西。麻不麻煩，累不累啊！有這個(gè)時(shí)間，我多看兩篇文獻(xiàn)，多編兩行 Python 代碼不好嗎？小編說(shuō)過(guò)，越基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)越是需要牢固掌握，但同樣越是基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)越是需要我們節(jié)省時(shí)間，提高效率。