熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization, FISH），縮寫為FISH，就是魚的意思，以此類推，做熒光原位雜交也叫釣魚。

       熒光原位雜交實(shí)驗(yàn) 它的實(shí)驗(yàn)原理也挺像釣魚的：它是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而探針可以直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。你們看，像不像在茫茫大海里面釣魚呢？探針像不像魚鉤呢？

 

釣魚實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)：操作煩瑣，步驟簡單。

        說它操作煩瑣，是因?yàn)樗�的操作步驟巨多，每一步又需要相當(dāng)長的時(shí)間，如果自己標(biāo)探針的話每批標(biāo)本大約三天時(shí)間（買試劑盒只需一天，但價(jià)格昂貴），你說是不是很煩瑣？說它步驟簡單則是因?yàn)镕ISH只要操作過程仔細(xì)，嚴(yán)格按照操作步驟操作，很容易做成功，比PCR要簡單得多。將繁瑣的簡單步驟做好也是有門道的。

        探針設(shè)計(jì)，量身定制 探針就是魚鉤。魚鉤不管用，還能釣得上大魚嗎？設(shè)計(jì)探針要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要來進(jìn)行，也就是說你要檢測的目的基因決定你的探針設(shè)計(jì)。這就像是一個(gè)老練的漁夫會(huì)根據(jù)不同的魚的種類來選擇魚鉤一樣。舉個(gè)例子，如果目的基因大概是1.8KB，可以直接對PCR產(chǎn)物進(jìn)行生物素標(biāo)記。也可以找技術(shù)服務(wù)公司幫你設(shè)計(jì)合成探針，每條探針設(shè)計(jì)合成大概3500。

 

組織切片和載玻片的選擇

        組織切片4～5μm 厚，過厚或過薄的切片均會(huì)對信號的強(qiáng)弱產(chǎn)生影響，而且切片應(yīng)完整，質(zhì)量良好，否則會(huì)在預(yù)處理時(shí)掉片。載玻片的選擇建議使用防脫載玻片，有條件的實(shí)驗(yàn)室可使用更好的陽離子或者陰離子專用載玻片，可有效防止脫片現(xiàn)象的發(fā)生。

注意標(biāo)本預(yù)處理細(xì)節(jié)

        標(biāo)本的處理也是關(guān)系到最后信號強(qiáng)弱的關(guān)鍵，但有些人不注意這些細(xì)節(jié)，結(jié)果造成熒光信號弱，難以分辨。這與預(yù)處理不當(dāng)造成探針難以達(dá)到飽和而雜交難以進(jìn)行有關(guān)。

變性要規(guī)范

       這一步是FISH關(guān)鍵中的關(guān)鍵。變性包括標(biāo)本變性和探針變性，這兩個(gè)步驟關(guān)系到FISH的成敗，千萬要嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，不但如此，特殊標(biāo)本還要自己摸條件。試想變性不徹底，DNA的雙鏈都沒能完全打開，雜交能順利進(jìn)行嗎？

操作熒光抗體時(shí)要避光

        操作熒光抗體的時(shí)候千萬要避光，否則將前功盡棄啊。舉個(gè)例子吧。魚竿，魚鉤，魚餌都備齊了，也不能保證一定就能釣到大魚兒。魚兒上鉤了之后，還有一個(gè)把魚拖上岸的最終過程。在FISH，就是使用熒光顯微鏡觀察和記錄結(jié)果。在正常情況下，目前商業(yè)化的探針即使是雜交以后，熒光信號能保存半年之久。有時(shí)候，信號也會(huì)急劇衰減，幾分鐘后就不見了。就像魚兒一開始上鉤了，馬上又掙脫魚鉤，重返大海了。出現(xiàn)這種情況，就是由于沒有嚴(yán)格避光。因此在觀察和記錄的時(shí)候，要盡可能地在暗室里面操作。這和以前洗照片是一個(gè)原理哈。

        當(dāng)然，也有偷懶的招術(shù)。那就是：抗熒光淬滅劑（antifade），在封片觀察的時(shí)候加入，可以延緩熒光的淬滅。注意：如果一次沒有成功，可以將探針洗掉，再進(jìn)行雜交。這又像極了釣魚。第一次魚兒脫鉤了，我們可以換個(gè)魚鉤再釣，直到釣到大魚為止。

 

        FISH其實(shí)做出來還是很漂亮很漂亮的。下面就是一張F(tuán)ISH的圖，讓我們一起感受一下生物學(xué)的大美。