摘要：

采用異硫氰酸苯酯（PITC）為柱前衍生試劑進(jìn)行氨基酸衍生，二元流動(dòng)相程序洗脫方法分離17種常見氨基酸，分離效果好，無需柱后反應(yīng)裝置，反應(yīng)速度快，保留時(shí)間重現(xiàn)性好。

實(shí)驗(yàn)部分：

儀器與試劑：

Labtech LC600高效液相色譜儀；Labtech 氨基酸色譜柱（5um, 250×4.6mm）；17種氨基酸標(biāo)樣；乙腈（色譜純）；水（超純水）；醋酸鈉（分析純）；醋酸（分析純）；三乙胺；異硫氰酸苯酯。

色譜條件：

流動(dòng)相A：乙腈/B＝1/1（V：V），流動(dòng)相B：50mmolNaAC緩沖溶液（PH=6.5）流速：1ml/min，進(jìn)樣1uL（自動(dòng)進(jìn)樣方式），檢測波長：254nm，柱溫為40℃。

梯度程序：

柱前衍生步驟：

1.      17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取適量天門東氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、胱氨酸于容量瓶中，以0.1N鹽酸定容，得到2.5mmol/L混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液（其中胱氨酸1.25mmol/L）。

2.      1mol/L三乙胺乙腈溶液：取三乙胺139ul，加乙腈860ul。

3.      1mol/L異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液：取12ulPITC加乙腈988ul。

4.      對(duì)照品溶液的衍生：取氨基酸溶液800ul置離心管中，加1mol/L異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液400ul，1mol/L三乙胺乙腈溶液400ul，混勻，室溫放置1小時(shí)，加入正己烷1.6ml，放置10分鐘，取下層溶液進(jìn)樣。

結(jié)果與討論：

   取衍生好的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品，連續(xù)測定10次，因第一次進(jìn)樣系統(tǒng)未完全平衡好，保留時(shí)間有漂移，最后一次進(jìn)樣由于室內(nèi)溫度較高，考慮到樣品放置時(shí)間長可能會(huì)對(duì)峰面積有影響，故舍去第一與最后一次進(jìn)樣，統(tǒng)計(jì)8次進(jìn)樣結(jié)果和重疊色譜圖如下，

氨基酸重復(fù)性結(jié)果（n＝8）

8次重復(fù)進(jìn)樣色譜圖

從數(shù)據(jù)可得知保留時(shí)間有較好的重現(xiàn)性，最大RSD0.31%，由于進(jìn)樣1ul，進(jìn)樣量較小，所以峰面積的RSD稍大，在實(shí)際測定工作當(dāng)中可以加大進(jìn)樣量和添加內(nèi)標(biāo)的方式改善。