免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence technique）是一種以熒光物作為標(biāo)記物的免疫分析技術(shù)，熒光物質(zhì)分子在特定條件下吸收激發(fā)光的能量后，分子呈激發(fā)態(tài)而極不穩(wěn)定，其迅速回到基態(tài)時(shí)，可以電磁輻射形式釋放出所有的光能，發(fā)射出波長(zhǎng)較照射光長(zhǎng)的熒光。用熒光素與已知的抗體（或抗原，較少用）結(jié)合，但不影響其免疫活性，然后可將熒光素標(biāo)記的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測(cè)和鑒定未知的抗原。在熒光顯微鏡下可以直接觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復(fù)合物。

常用的熒光素主要有：

1 ．異硫氰酸熒光素 （FITC） ，最大吸收光譜為 490~495nm ，最大發(fā)射光譜為 520~530nm ，呈黃綠色熒光。

2 ．四乙基羅丹明 （RB200） ，最大吸收光譜為 570nm ，最大發(fā)射光譜為 595~600nm ，呈明亮橙色熒光。

3 ．四甲基異硫氰酸羅丹明 （TRITC） ，最大吸收光譜為 550nm ，最大發(fā)射光譜為 620nm ，呈橙紅色熒光。

一、 FITC 標(biāo)記抗體技術(shù)

在堿性條件下， FITC 的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰氨化而形成硫碳氨基鍵，成為標(biāo)記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。

目前一般實(shí)驗(yàn)使用的熒光抗體多為商品化試劑，不需自己合成。

二、熒光抗體染色法

實(shí)驗(yàn)原理

熒光抗體染色技術(shù)的基本原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，用標(biāo)記有熒光素的熒光抗體檢測(cè)待檢抗原樣本，如形成抗原抗體復(fù)合物，則其在藍(lán)紫光或紫外光照射下發(fā)出熒光，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。本實(shí)驗(yàn)常用于測(cè)定細(xì)胞表面抗原和受體，各種病原微生物的快速檢查和鑒定，組織內(nèi)抗原的定性和定位研究以及各種自身抗體的檢測(cè)等。經(jīng)典的熒光抗體技術(shù)包括直接法、間接法和補(bǔ)體法。

實(shí)驗(yàn)材料

1 ．抗原 呼吸道合胞病毒 （RSV） （或待檢標(biāo)本）

2 ．細(xì)胞 Hep-2 （或 Hela ）細(xì)胞單層

3 ．熒光抗體 1:40 抗 RSA IgG-FITC 標(biāo)記物； 1:40 抗兔 IgG-FITC 標(biāo)記物

4 ．中間抗血清 1:200 兔抗 RSV 免疫血清 （Abt）

實(shí)驗(yàn)方法

1.制備抗原片

⑴ RSV 感染細(xì)胞：用 RSV 感染 Hep-2 或 Hela 細(xì)胞單層培養(yǎng)物，在細(xì)胞未出現(xiàn) CPE 前，用胰酶消化使分散，并配制成 4-6 ′ 10 5 個(gè) /ml 的細(xì)胞懸液，用吸管將細(xì)胞懸液滴加到 10 點(diǎn)鍍膜玻片上，每個(gè)圓點(diǎn)上約 0.025ml ，再將鍍膜玻片放入二氧化碳孵箱， 37 ° C 培養(yǎng) 6~24 小時(shí)。培養(yǎng)后的玻片用 pH7.4 的 PBS 漂洗 3 次，干燥后固定。

⑵ 固定：將玻片放入盛有冷丙酮的洗缸中， 4 ° C 固定 20 分鐘，漂洗，自然干燥。

⑶ 抗原片的保存：固定好的抗原片最好立即進(jìn)行熒光抗體染色，若必須保存時(shí)，置于低溫下密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

2.熒光抗體染色法

⑴ 直接染色法 直接使熒光抗體與玻片上的抗原反應(yīng)。

① 用吸管滴加 1:40 抗 RSV IgG-FITC 標(biāo)記物，使其布滿整個(gè)標(biāo)本區(qū)。將玻片置濕盒中， 37 ° C 孵育 30 分鐘。

② 將玻片取出，用自來水沖去多余的標(biāo)記抗體液后，用 PBS 漂洗 3 次，每次 5 分鐘。最后用蒸餾水沖洗 1 次，晾干。

③ 用純度高的甘油封片，鏡檢。

⑵ 間接染色法

① 用吸管吸取 1:200 兔抗 RSV 免疫血清，滴于抗原片上，使其布滿整個(gè)標(biāo)本區(qū)，約 0.025ml 。將玻片置濕盒 37 ° C 孵育 30~40 分鐘， PBS 漂洗 3 次，每次 2 分鐘。

② 滴加 1:40 抗兔 IgG-FITC 標(biāo)記物于抗原片上，約 0.025ml 。將玻片置濕盒 37 ° C 孵育 30~40 分鐘， PBS 漂洗 3 次，每次 5 分鐘。標(biāo)本不要太干，各染液勿混流。

③ 0.02% 伊文思藍(lán)覆蓋 5 分鐘，去染液加甘油封片，鏡檢。

結(jié)果判定

熒光顯微鏡下所觀察到的熒光圖象主要以兩個(gè)指標(biāo)判斷結(jié)果，一是形態(tài)學(xué)特征，一是熒光的亮度，必須將兩者結(jié)合起來綜合判斷。

特異性熒光呈黃綠色，其強(qiáng)度用“ ++++ ”、“ +++ ”、“ ++ ”、“ + ”、“—”表示。

思考題

1. 何謂免疫標(biāo)記技術(shù)？常用的免疫標(biāo)記法有那些？

2. 熒光抗體染色的原理是什么？有那些常見方法？

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（間接法）

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) （enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA） 是一種用酶標(biāo)記抗體或抗原，對(duì)相應(yīng)的抗原或抗體進(jìn)行測(cè)定的免疫標(biāo)記技術(shù)。他利用了抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性，可敏感地檢測(cè)體液中微量的特異性抗原或抗體，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)單、結(jié)果便于觀察、可用于大規(guī)�？焖贆z測(cè)等特點(diǎn)。常用方法有直接法、間接法、夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法等。

常用標(biāo)記酶有：辣根過氧化物酶 （HRP） ，堿性磷酸酶 （AP） ，葡萄糖氧化酶 （GOD） 等。

實(shí)驗(yàn)原理

先將用于檢測(cè)特異性抗體的已知抗原結(jié)合到固相載體上，再先后加入待測(cè)抗體和酶標(biāo)二抗進(jìn)行反應(yīng)，其間通過洗液的洗滌去除未能固化到固相載體上的成分，這樣因?yàn)榭乖�抗體反應(yīng)的特異性，就保正了只有當(dāng)檢測(cè)標(biāo)本中含可與已知抗原特異性結(jié)合的抗體時(shí)，標(biāo)記的酶才能在反應(yīng)孔中存在而不被洗去，當(dāng)加入酶的底物后，底物被酶催化產(chǎn)生有色的產(chǎn)物，通過目測(cè)或分光光度計(jì)檢測(cè) OD 值就可測(cè)出底物的降解量，從而推知存在于標(biāo)本中的抗體量。

實(shí)驗(yàn)材料

1. 40 孔酶標(biāo)板

2. 1:300 乙肝表面抗原溶液

3. 1:10 待測(cè)血清

4. 健康人血清

5. HBsAg 診斷血清

6. 辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人 IgG 抗體（酶標(biāo)二抗）

7. 抗原稀釋液（ pH9.6 碳酸鹽緩沖液）

8. 洗滌液（ pH7.4 磷酸鹽—吐溫緩沖液）

9. 血清稀釋液（含 0.1% 牛血清白蛋白的磷酸鹽—吐溫緩沖液）

10. 底物顯色劑（鄰苯二胺—— H 2 O 2 溶液）

11. 終止液（ 2M H 2 SO 4 ）

實(shí)驗(yàn)方法

1.包被抗原:用抗原稀釋液將HBsAg按1:300稀釋成工作濃度,加入到40孔酶標(biāo)板1-9孔,每孔0.1ml。第10孔加稀釋液作空白對(duì)照。酶標(biāo)板置濕盒內(nèi),4°C孵育過夜。

2 ．洗滌：次日,甩去酶標(biāo)板中液體,每孔加洗滌液至滿,室溫放置3分鐘后,甩干,再加入洗滌液,重復(fù)3遍。目的在于去除未吸附的抗原,最后甩干。

3. 加待測(cè)血清：用血清稀釋液倍比稀釋待測(cè)血清，方法如下表：

每管取 0.1ml 分別加入到酶標(biāo)板相應(yīng)的 1~7 孔內(nèi)。第 8 孔加入 0.1ml 健康人血清，作陰性對(duì)照。第 9 孔加入 0.1ml HBsAg 診斷血清，作陽(yáng)性對(duì)照。酶標(biāo)板置濕盒內(nèi)， 37 ° C 孵育 30 分鐘。

4. 洗滌：甩干酶標(biāo)板中的液體，用洗滌液按照步驟 2 中的方法洗滌 3 遍，最后甩干。

5 ．加酶標(biāo)二抗：將稀釋好的酶標(biāo)記羊抗人 IgG 抗體按每孔 0.1ml 加入 1~9 孔，第 10 孔仍只加 0.1ml pH7.4 磷酸緩沖液。酶標(biāo)板置濕盒內(nèi)， 37 ° C 孵育 30 分鐘。

6. 洗滌：同步驟 4 。

7. 加底物顯色：將新配制的鄰苯二胺—— H 2 O 2 溶液按每孔 0.1ml 加到 1~10 孔中，置濕盒 37 ° C 孵育或室溫靜置 10~15 分鐘。

8. 加終止劑一滴終止顯色反應(yīng)。

結(jié)果判定

第 10 孔為空白對(duì)照孔，無(wú)色，主要用于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀的調(diào)零。

第 9 孔為陽(yáng)性對(duì)照，顯棕黃色。

第 8 孔為陰性對(duì)照，無(wú)色（有時(shí)可因操作不精細(xì)或非特異性吸附而呈極淺的黃色）。

實(shí)驗(yàn)孔（ 1~7 孔）中結(jié)果陽(yáng)性者，呈棕黃色。隨著抗體量的遞減，顏色也逐漸變淺。

效價(jià)孔的判定，以與陰性對(duì)照孔有顯著性顏色差異的、血清稀釋度最高的實(shí)驗(yàn)孔為效價(jià)孔，其血清稀釋度即為所測(cè)抗體的效價(jià)。

注意事項(xiàng)：

1. 實(shí)驗(yàn)操作中，注意用于不同試劑的吸管、滴管不能混用，以免發(fā)生誤差而出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。

2. 鄰苯二胺屬有毒化學(xué)物質(zhì)，要避免和皮膚接觸。

思考題

1. 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的基本原理是什么？常用方法有那些？

2. 間接法和直接法相比各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？

放射免疫測(cè)定法—— 125 I 標(biāo)記技術(shù)

放射免疫測(cè)定 （radioimmunoassay, RIA） 是將同位分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，以放射性同位素作為示蹤物的標(biāo)記免疫測(cè)定方法。由于此項(xiàng)技術(shù)具有靈敏度高（可檢測(cè)出 ng 至 pg 級(jí)的微量物質(zhì)）、特異性強(qiáng)（可分辨結(jié)構(gòu)類似的抗原）、重復(fù)性好、樣品及試劑用量少、測(cè)定方法易規(guī)范化和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，因此在醫(yī)學(xué)及其他生物科學(xué)研究領(lǐng)域和臨床實(shí)驗(yàn)診斷中廣泛的應(yīng)用于各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物及腫瘤標(biāo)志物等的分析與定量測(cè)定。

RIA 常用的放射性同位素有 125I、 135I、 3H、14C等，其中以125I最常用。因其具有以下優(yōu)點(diǎn) ① 125 I 化學(xué)性質(zhì)活潑，容易標(biāo)記成功，可以用較簡(jiǎn)便的方法標(biāo)記抗原或抗體； ② 125I 衰變過程中不產(chǎn)生b射線，對(duì)標(biāo)記蛋白、多肽等抗原的免疫活性無(wú)顯著影響； ③ 容易獲得高比放性的標(biāo)記物，測(cè)定的靈敏度較高； ④ 釋放的g射線可以用晶體閃爍計(jì)數(shù)儀直接測(cè)量，方法簡(jiǎn)便，易于推廣應(yīng)用； ⑤ 125I的核素豐度、計(jì)數(shù)率及半衰期（125I60 天,135I 8.1 天）均優(yōu)與135I 。

標(biāo)記125I的氯胺T法：（標(biāo)記甲型肝炎病毒抗體—抗 HAV IgG）

實(shí)驗(yàn)原理

氯胺T是氯代酰胺類氧化劑，在水溶液中易分解形成次氯酸，將 125I-氧化成放射性單質(zhì)碘（125I2），其可取代酉各氨酸殘基苯環(huán)上的氫原子，或與組氨酸殘基的咪唑環(huán)共價(jià)連接，使蛋白質(zhì)或多肽發(fā)生碘化反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)材料

1. 抗 HAV IgG （約含蛋白 5mg/ml ）

2. Na 125 I （ 比放射性 >20mCi/ml） 1mlCi

3. 0.25M pH7.4 PBS ； 0.05M pH7.4 PBS

4. 氯胺 T 50 m l/100 m l （臨用前用 0.25M PBS 配置）

5. 偏重亞硫酸鈉 100 m g/100 m l （臨用前配置）

6. 1% KI （溶于 0.05M PBS ）

7. Sephadex G25 層析柱（ 1 × 20cm ）：稱 10g Sephadex G25 ，用 0.05M pH7.4 PBS 浸泡，漂洗后裝柱，然后用溶于同種緩沖液的 1% 牛血清白蛋白（ BSA ） 1ml 上柱封閉，以減少標(biāo)記蛋白通過時(shí)的吸附損耗。

8. 小試管 （用于收集洗脫液的試管應(yīng)先用 1%BSA 濕潤(rùn)以封閉管壁）

9. 微量進(jìn)樣器

10. 晶體閃爍計(jì)數(shù)儀

11.15% 三氯醋酸

實(shí)驗(yàn)方法

1. 取 1 小試管，加入抗 HAV IgG 2.5 m g ， 0.05M PBS 50 m l ， Na 125 I 800 m Ci （具體體積根據(jù) 125 I 衰減表查算）。

2. 再加入氯胺 T 30 m g （快速加入，立即震搖），室溫反應(yīng) 3 分鐘。

3. 加入偏重亞硫酸鈉 60 m g ，終止反應(yīng)。

4. 加入 1% KI 200 m l （作為載體，用以稀釋放射性碘，減少吸附）。

5. 將上述反應(yīng)液通過 Sephadex G25 層析柱，待液體進(jìn)入柱床后，用 0.05M PBS 洗脫，按每管 10 滴 / 分收集，共 45~50 管。

6. 用晶體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)量各管的放射值，將放射性最強(qiáng)的標(biāo)記蛋白 3~4 管合并，加 15% 三氯醋酸沉淀蛋白，離心。測(cè)定上清和沉淀的 cpm ，求出蛋白沉淀的 cpm 占總 cpm （上清 + 沉淀的 cpm ）的百分率。

7. 計(jì)算 125 I 標(biāo)記蛋白的比放射性：?jiǎn)挝恢亓繕?biāo)記蛋白上的放射性強(qiáng)度稱為重量比放射性。計(jì)算公式如下：
125 I 蛋白 （ m Ci/mg）= 所用 125 I 總放射性 （ m Ci）× 125 I 標(biāo)記率 / 所用蛋白總量 （ m g）

注意事項(xiàng)：由于實(shí)驗(yàn)中使用了放射性同位素，因此實(shí)驗(yàn)過程中所有含 125 I 的液體及試劑均不能隨意棄置，需集中處理。另外注意不要讓其濺入口、眼。

思考題：

1. 何為放射免疫測(cè)定法？其特點(diǎn)是什么？

2. 用 125 I 做為標(biāo)記物有何優(yōu)點(diǎn)？

125 I 衰減表