1、為什么在免疫組化中標(biāo)本要進(jìn)行固定？

（1）防止標(biāo)本從玻片上脫落；

（2）除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；

（3）固定的標(biāo)本易于保存。

2、標(biāo)本固定的基本原則是什么？

（1）不能損傷細(xì)胞內(nèi)的抗原；

（2）不能凝集蛋白質(zhì)；

（3）不能損傷細(xì)胞形態(tài)；

（4）固定后應(yīng)保持細(xì)胞膜的通透性，以允許抗體進(jìn)入與抗原結(jié)合。

3、常用抗原物質(zhì)的固定方法的*佳選擇是什么？

（1）丙酮的作用是溶解膜磷脂，所有的脂質(zhì)雙層（胞膜、核膜、細(xì)胞器膜等）已被破壞，但蛋白和多糖類不受影響。而丙酮固定后不需進(jìn)行抗原修復(fù)，它是一種非交聯(lián)固定劑。

（2）多聚甲醛固定對(duì)酶類和脂類保護(hù)的好，易與蛋白發(fā)生交聯(lián)，所以一般經(jīng)過甲醛或PFA固定后的標(biāo)本一般需要抗原修復(fù)。

（3）蛋白質(zhì)抗原：95%~100%乙醇；

（4）酶、激素：丙酮；

（5）免疫球蛋白：四氯化碳；

（6）病毒：丙酮、四氯化碳、無水乙醇；

（7）多糖、細(xì)菌等：微火加熱，甲醇、10%甲醛、丙酮；

（8）類脂（異嗜性抗原）：10%甲醛，10%佛茂爾（ForMol）。

4、固定的步驟有哪些（包括固定時(shí)間、條件等）？

（1）切片前的組織固定：一般石蠟切片前需對(duì)組織進(jìn)行固定，多為12~24h。

（2）切片后的組織細(xì)胞固定：一般室溫5~10min，4度30~60min。

5、各種固定方法的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？

1）醛類固定劑：雙功能交聯(lián)劑，其作用是使組織之間相互交聯(lián)，保存抗原于原位，其特點(diǎn)是對(duì)組織穿透性強(qiáng)，收縮性小。有人認(rèn)為它對(duì)IgM、IgA、J鏈、K鏈和肓吹謀曇切Ч�良好，眽m扒邐�，蕼\Ｓ玫墓潭�剂�£

2）非醛類固定劑Pe等人比較幾種非醛類雙功能試劑指出，碳化二亞胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亞胺、和對(duì)苯醌等均適用于多肽類激素的組織固定，單獨(dú)使用時(shí)，邊緣固定效應(yīng)重，但與戊二醛或多聚甲醛混合使用，效果明顯改善。

3）丙酮及醇類固定劑：系*初免疫細(xì)胞化學(xué)染色的固定劑，其作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖，對(duì)組織穿透性很強(qiáng)，保存抗原的免疫活性較好。但醇類對(duì)低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，解決的辦法是和其它試劑混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。

6、哪些情況下不需要對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行固定？

研究細(xì)胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定。

7、常用固定劑的種類和配方是什么？

（1）4%多聚甲醛磷酸緩沖液pH7.4（多聚甲醛40g，0.1mol/LPBS液pH7.4500ml，兩者混

合加熱至60℃，攪拌并滴加1NNaOH至清晰為止，冷卻后加PBS液至總量1000ml）。

（2）10%中性緩沖福爾馬林液（濃甲甲醛10ml，0.01mol/lpH7.4PBS90ml）。

（3）100%冰丙酮。

（4）戊二醛-甲醛液（戊二醛1ml，濃甲醛10ml，蒸餾水加至100ml）。

（5）甲醛升汞固定液（即B5固定液。濃甲醛10ml，氯化汞6g，醋酸鈉1.25g，蒸餾水90ml）。

（6）醋酸-甲醛液（濃甲醛10ml，冰醋酸3ml，生理鹽水加至100ml）。

（7）Bouin’s液。

（8）Zamboni’s液。采用2.5%多聚甲醛和30%飽和苦味酸，更可增加對(duì)組織穿透力和固定效果，以保存更多的組織抗原。

（9）PLP液（過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液）。

（10）碳化二亞胺（1-ethyl-3（3-dimethyl-aminopropyl）cardodiimi-HCI）液：2g溶于100ml0.01mol/L，pH7.4PBS中。此液宜用于標(biāo)記多肽類激素的組織，對(duì)標(biāo)記IgA、IgG效果不佳。

（11）碳二亞胺-戊二醛液（ECD-G液）。

（12）Zenker’s液（重鉻酸鉀2.5g，氯化汞5g，硫酸鈉1g，蒸餾水100ml，混合溶解后，臨用時(shí)加水醋酸5ml）。

（13）Clarke氏改良劑（100%酒精95ml，冰醋酸5ml），用于冰凍切片的后固定。

（14）乙醚（或氯仿）與乙醇等量混合液。

（15）AAF液：95%-100%酒精85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10ml。

（16）Carnoy氏液：100%酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（17）Methacarn氏液：甲醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

丙酮的組織穿透性和脫水性更強(qiáng)，常用于冰凍切片及細(xì)胞涂片的后固定，保存抗原性較好，平時(shí)4℃低溫保存?zhèn)溆�，臨用時(shí)，只需將涂片或冰凍切片插入冷丙酮內(nèi)5-10min，取出后自然干燥，貯存于低溫冰箱備用。