1．1 儀器 、試劑和材料

1．1．1  儀 器  高效液相色譜儀系統(tǒng)包括 Water515泵 ，Waters 2475熒光 檢測器 ，Empower色譜工作站，Rheodyne 7725 i型手動進(jìn)樣 閥．Sigma 3 K 18高速離心機．超聲波振蕩器（KQ-250 E型，昆山），混合器（CAT，14—31，日本 ）

1．1．2 試劑  標(biāo)準(zhǔn)樣品 ：天冬氨酸 （Asp）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、組氨酸 （His）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、胱 氨 酸 （cys一2）、酪 氨 酸 （Tyr）、纈 氨 酸（Va1）、蛋 氨 酸 （Met）、賴 氨 酸 （Lys）、異亮 氨 酸（Ile）、亮氨 酸 （Leu）、苯丙 氨酸 （Phe），均 為色譜純 ，美 國 SIGMA公司 ，L一正纈氨酸 ，色譜純，醫(yī)藥．3一巰基丙酸 （色譜純）鹽酸 、醋酸鈉 、硼酸鈉 、氫氧化鈉、三乙胺均為分析純，甲醇、四氫呋喃、乙腈、醋酸均為色譜純，水為超純水．

1．1．3 材料 中二級 白肋煙葉

1．2 色譜條件

色譜柱 ：依 利特 c 。柱 （4．6 mm i．d．×250mm，5  m）流動相 A：（1．247±0．025）g醋酸鈉 ，溶于適量純水 ，加 100 wL三乙胺，用體積分?jǐn)?shù)為 1％ 醋酸調(diào) pH值 至 7．20±0．05，再加入 1．5 mL四氫呋喃，混合均勻 ，定溶至 500 mL后用0．45 m的濾膜過濾后備用．流動相 B：（2．520±0．025）g醋酸鈉 ，加入 200 mL純水溶解 ，用體積分?jǐn)?shù)為 1％醋酸調(diào) pH值至 7，20±0．05，加到400 mL乙腈和400mL甲醇的混合物中，混合均勻后用0，45 m的濾膜過濾后備用．流速 ：1．0 mL·min～．柱溫 ：40℃． 檢測器 ：熒光檢測器 ，激發(fā)波長 350 Hi，發(fā)射波長450 nm．進(jìn)樣量：20 wL．淋洗梯度如表 1．1．3 衍生化試劑的配制 稱取鄰苯二 甲醛 5 mg于 2 mL的小瓶 中，加入 0．1 mL的甲醇，然后再加入 0．1 moL·L  的緩沖 溶液 1 mL，震蕩使其溶解后加入 20 L的 3一巰基 丙酸，震蕩均勻后儲藏與2 oC的冰箱中待用．

1．4 樣品的前處理

稱取粉碎后的煙末 2．0 g，放入 50 mL的容量 瓶中，加入 5 mL 0．1 mol·L  的 HC1和 0．2 mL 1．016 mg·L 的 L一正纈氨酸溶液 （內(nèi)標(biāo) ），定容 后用超聲波萃取 20 min，然后在高速離心機上以 12 000 r·min 的轉(zhuǎn)速離心 20 min，上清液用干燥 過濾器經(jīng) 0．45  m微膜過濾．再用微 量吸取器吸 取 25  L硼酸緩沖液加入 1 mL衍生管 中，再吸取 5  OPA試劑加入衍生管中，然后吸取樣品過濾過的樣品液 10 L，在混合器混合均勻，吸取 5 L

3一MPA試劑，再在 混合 器上 混合 均 勻，放 置10 minflp可進(jìn)樣．

1．5 氨基酸的定性和定量分析

用標(biāo)樣色譜圖、文獻(xiàn)參照和標(biāo)樣加入的方法， 通過對照保留時間進(jìn)行定性 ，對氨基酸的出峰順序 加以確認(rèn) ；采用 內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析．即先根據(jù)氨 基酸標(biāo)樣與內(nèi)標(biāo)物色譜峰的峰 面積之 比與相應(yīng)的 氨基酸濃度制作各氨基酸的工作曲線，求出相應(yīng)的 線性方程 ，然后 由待測樣品中各氨基酸與內(nèi)標(biāo)的色 譜峰峰面積之比，求出相應(yīng)氨基酸的含量．3  小結(jié) 白肋煙葉樣品 17種氨基酸測定 的變異系數(shù)為

2．32％ -9．24％，標(biāo)準(zhǔn)回收率為 95．．3％ 一100．7％．說 明該方法精密度和準(zhǔn)確度較高，而且該方法具有檢測 速度快、分離效果好、樣品需求量少 ，樣品制備程序簡單、人為因素影響少等優(yōu)點，適于推廣應(yīng)用．本企業(yè)公司：www.hzrush.com、www.jxsxgs.com。