Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實(shí)驗(yàn)原理：
真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA—binding domain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構(gòu)建與基因的ORFs融合的激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載爿體，順式作用元件與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD融合構(gòu)建載體，分別轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時(shí)，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報(bào)告基因的表達(dá)，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性�；蜣D(zhuǎn)錄實(shí)際上是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結(jié)果，這種結(jié)合猶如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質(zhì)互作的基礎(chǔ)。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1.1   RNA提取

1.2   mRNA分離

1.3   cDNA初級文庫的構(gòu)建
1.3.1 cDNA鏈的合成
1.3.2 cDNA第二鏈的合成
1.3.3 cDNA adapter的制備
1.3.4 cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5 cDNA分級分離
1.3.6 BP重組
1.3.7 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8 文庫克隆檢測
1.3.9 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

1.4   cDNA次級文庫的構(gòu)建
1.4.1 初級文庫的質(zhì)粒抽提
1.4.2 LR重組
1.4.3 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.4.4 文庫克隆檢測
1.4.5 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實(shí)驗(yàn)原理：
真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA—binding domain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，淳風(fēng)生物科技,銀川酵母單雜交文庫構(gòu)建
,西安淳風(fēng)生物科技有限公司，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構(gòu)建與基因的ORFs融合的激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD融合構(gòu)建載體，分別轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時(shí)，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報(bào)告基因的表達(dá)，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性�；蜣D(zhuǎn)錄實(shí)際上是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結(jié)果，這種結(jié)合猶如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質(zhì)互作的基礎(chǔ)。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1.1   RNA提取

1.2   mRNA分離

1.3   cDNA初級文庫的構(gòu)建
1.3.1 cDNA鏈的合成
1.3.2 cDNA第二鏈的合成
1.3.3 cDNA adapter的制備
1.3.4 cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5 cDNA分級分離
1.3.6 BP重組
1.3.7 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8 文庫克隆檢測
1.3.9 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

1.4   cDNA次級文庫的構(gòu)建
1.4.1 初級文庫的質(zhì)粒抽提
1.4.2 LR重組
1.4.3 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.4.4 文庫克隆檢測
1.4.5 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
次級文庫庫容大于107，淳風(fēng)生物科技,銀川酵母單雜交文庫構(gòu)建
,西安淳風(fēng)生物科技有限公司，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實(shí)驗(yàn)原理：
真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA—binding domain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄氵因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構(gòu)建與基因的ORFs融合的激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD融合構(gòu)建載體，分別轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時(shí)，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報(bào)告基因的表達(dá)，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性�；蜣D(zhuǎn)錄實(shí)際上是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結(jié)果，這種結(jié)合猶如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質(zhì)互作的基礎(chǔ)。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1.1   RNA提取

1.2   mRNA分離

1.3   cDNA初級文庫的構(gòu)建
1.3.1 cDNA鏈的合成
1.3.2 cDNA第二鏈的合成
1.3.3 cDNA adapter的制備
1.3.4 cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5 cDNA分級分離
1.3.6 BP重組
1.3.7 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8 文庫克隆檢測
1.3.9 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

1.4   cDNA次級文庫的構(gòu)建
1.4.1 初級文庫的質(zhì)粒抽提
1.4.2



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