Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實(shí)驗(yàn)原理：
酵母雙雜交系統(tǒng)是在酵母體內(nèi)通過重建有活性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)來鑒定蛋白質(zhì)之間的相互作用。轉(zhuǎn)錄因子可以和DNA上特異的序列結(jié)合而啟動相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。這種DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄因子上兩個相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Binding Domain, BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation Domain, AD)分別來完成的，并且這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄激活都是必須的。在GAL4系統(tǒng)中利用轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD與激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白若發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，淳風(fēng)生物科技,南寧酵母雙雜交文庫構(gòu)建
,西安淳風(fēng)生物科技有限公司，從而與上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報告基因的表達(dá)，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性。酵母雙雜交文庫的構(gòu)建是篩庫的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規(guī)模篩選分析蛋白質(zhì)間的相互作廴用，是現(xiàn)在分子生物學(xué)與生物化學(xué)常用的手段。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1.1   RNA提取

1.2   mRNA分離

1.3   cDNA初級文庫的構(gòu)建
1.3.1 cDNA鏈的合成
1.3.2 cDNA第二鏈的合成
1.3.3 cDNA adapter的制備
1.3.4 cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5 cDNA分級分離
1.3.6 BP重組
1.3.7 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8 文庫克隆檢測
1.3.9 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

1.4   cDNA次級文庫的構(gòu)建
1.4.1 初級文庫的質(zhì)粒抽提
1.4.2 LR重組
1.4.3 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.4.4 文庫克隆檢測
1.4.5 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。
Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實(shí)驗(yàn)原理：
酵母雙雜交系統(tǒng)是在酵母體內(nèi)通過重建有活性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)來鑒定蛋白質(zhì)之間的相互作用。轉(zhuǎn)錄因子可以和DNA上特異的序列結(jié)合而啟動相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。這種DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄因子上兩個相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Binding Domain, BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation Domain, AD)分別來完成的，并且這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄激活都是必須的。在GAL4系統(tǒng)中利用轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD與激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白若發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報告基因的表達(dá)，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性。酵母雙雜交文庫的構(gòu)建是篩庫的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規(guī)模篩選分析蛋白質(zhì)間的相互作用，是現(xiàn)在分子生物學(xué)與生物化學(xué)常用的手段。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1.1   RNA提取

1.2   mRNA分離

1.3   cDNA初級文庫的構(gòu)建
1.3.1 cDNA鏈的合成
1.3.2 cDNA第二鏈的合成
1.3.3 cDNA adapter的制備
1.3.4 cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5 cDNA分級分離
1.3.6 BP重組
1.3.7 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8 文庫克隆檢測
1.3.9 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

1.4   cDNA次級文庫的構(gòu)建
1.4.1 初級文庫的質(zhì)粒抽提
1.4.2 LR重組
1.4.3 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.4.4 文庫克隆檢測
1.4.5 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
次級文庫庫容大于107，重組率大于9冂0%，平均插入片段大于1kb。
Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實(shí)驗(yàn)原理：
酵母雙雜交系統(tǒng)是在酵母體內(nèi)通過重建有活性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)來鑒定蛋白質(zhì)之間的相互作用。轉(zhuǎn)錄因子可以和DNA上特異的序列結(jié)合而啟動相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。這種DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄因子上兩個相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Binding Domain, BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation Domain, AD)分別來完成的，并且這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄激活都是必須的。在GAL4系統(tǒng)中利用轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD與激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白若發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報告基因的表達(dá)，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性。酵母雙雜交文庫的構(gòu)建是篩庫的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規(guī)模篩選分析蛋白質(zhì)間的相互作用，淳風(fēng)生物科技,南寧酵母雙雜交文庫構(gòu)建
,西安淳風(fēng)生物科技有限公司，是現(xiàn)在分子生物學(xué)與生物化學(xué)常用的手段。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1.1   RNA提取

1.2   mRNA分離

1.3   cDNA初級文庫的構(gòu)建
1.3.1 cDNA鏈的合成
1.3.2 cDNA第二鏈的合成
1.3.3 cDNA adapter的制備
1.3.4 cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5 cDNA分級分離
1.3.6 BP重組
1.3.7 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8 文庫克隆檢測
1.3.9 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

1.4   cDNA次級文庫的構(gòu)建
1.4.1 初級文庫的質(zhì)粒抽提
1.4.2 LR重組
1.4.3 電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.4.4 文庫克隆檢測
1.4.5 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。

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