染料法Candidatus Mycoplasma haemaarvum實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒

Dye-quantitative Real-time PCR Kit for Candidatus Mycoplasma haemaarvum

貨號(hào)：Mqs-hpa-20      規(guī)格：20個(gè)反應(yīng)

貨號(hào)：Mqs-hpa-50      規(guī)格：50個(gè)反應(yīng)

貨號(hào)：Mqs-hpa-100     規(guī)格：100個(gè)反應(yīng)

儲(chǔ)存：-20度，避光保存，有效期年。避免反復(fù)凍融。

試劑盒特點(diǎn)：

1，    特異性識(shí)別Candidatus Mycoplasma haemaarvum，與其他生物基因組無(wú)交叉反應(yīng)。

2，    使用熱啟動(dòng)的DNA聚合酶，可抑制非特異性擴(kuò)增，降低背景熒光。

3，    帶有陽(yáng)性對(duì)照樣品（組分C），可用于檢驗(yàn)試劑盒有效性，以及驗(yàn)證待測(cè)樣品中是否含有PCR抑制劑。

4，    帶有ROX參比染料，幫助校正加樣誤差和管間差異。

5，    帶有UDG酶和dUTP，可降低殘留DNA的污染。

目已知寄生于犬血中的支原體有兩種： Candidatus Mycoplasma haemaarvum和犬血支原體（Mycoplasma haemocanis ，舊稱Haemobartonella canis)。在2004年于只脾切除手術(shù)后的犬中次發(fā)現(xiàn)Candidatus Mycoplasma haemaarvum，隨后發(fā)現(xiàn)其在多個(gè)地區(qū)廣泛分布，陽(yáng)性率在0-33.3%不等。Candidatus Mycoplasma haemaarvum與Candidatus Mycoplasma haemominutum較為相似，直徑為0.3微米，無(wú)成串相連現(xiàn)象，很少引起明顯的溶血，除非是做了脾切除手術(shù)或者發(fā)生了免疫抑制。

常用的檢測(cè)方法包括顯微鏡鏡檢法和PCR法。鏡檢法靈敏度低，實(shí)驗(yàn)誤差大，無(wú)法區(qū)分支原體種類，易受血液中其他物質(zhì)以及人工涂片方法的干擾，且支原體易從紅細(xì)胞表面脫落，造成漏檢。而PCR法在靈敏度上則有明顯的優(yōu)勢(shì)，且可以區(qū)分支原體種類。定量PCR法與普通PCR法相比，不僅可以精確定量，而且操作更為方便，更少受環(huán)境污染的影響。

本試劑盒針對(duì)Candidatus Mycoplasma haemaarvum的16S rRNA基因的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物，與其他生物基因組沒(méi)有交叉反應(yīng)。

本試劑盒包含熱啟動(dòng)DNA聚合酶、dNTP（以UTP代替了TTP）、引物、陽(yáng)性對(duì)照品、SYBR Green I染料、ROX染料，和用以防止殘余DNA污染的UDG（尿嘧啶-N-糖苷酶），用戶只需準(zhǔn)備好DNA樣品即可使用。

熱啟動(dòng)DNA聚合酶結(jié)合了特異性單克隆抗體，在室溫下聚合酶活性被抗體抑制。在PCR循環(huán)的變性階段，抗體受熱被去除，聚合酶活性恢復(fù)，因此獲得“熱啟動(dòng)”功能，可減少殘余DNA的污染，提高PCR擴(kuò)增效率、靈敏度和目的片段產(chǎn)量。

SYBR Green I可以與DNA雙鏈的小溝結(jié)合，結(jié)合后在497nm激發(fā)光照射下產(chǎn)生520nm的發(fā)射光。未結(jié)合雙鏈DNA的SYBR Green I基本不產(chǎn)生熒光。因此可以根據(jù)熒光值的大小判斷溶液內(nèi)DNA雙鏈的多寡，用于實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物的累積量。初始模板濃度越高，反應(yīng)循環(huán)數(shù)越高，則雙鏈DNA含量越高，熒光值也就越高。值得注意的是，SYBR Green I也可以結(jié)合非特異性PCR產(chǎn)物以及引物二聚體，此時(shí)產(chǎn)生的熒光與目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)法區(qū)分。為了判斷熒光信號(hào)是否來(lái)自目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物，可以繪制熔解曲線。通過(guò)逐步緩慢升溫，使雙鏈DNA解離為單鏈DNA，同時(shí)檢測(cè)熒光值的變化，繪制曲線，根據(jù)熒光值觀察DNA解鏈的溫度。

UDG和dUTP可以阻止次步驟殘余DNA的擴(kuò)增。dUTP可以確保擴(kuò)增后的DNA中均含有尿嘧啶。UDG可從單鏈或雙鏈DNA上去除尿嘧啶殘基，從而阻止含有尿嘧啶的DNA作為下幾輪PCR的模板。在PCR循環(huán)開始的UDG孵育步驟，可以破壞帶有尿嘧啶的PCR產(chǎn)物。經(jīng)過(guò)該去除污染步驟后，UDG在正常的PCR循環(huán)過(guò)程中被高溫滅活，對(duì)PCR反應(yīng)沒(méi)有影響。

ROX不參與PCR反應(yīng)，在PCR反應(yīng)過(guò)程中熒光沒(méi)有變化，可以提供條基線用于校正加樣誤差和管間差異，便于儀器自動(dòng)分析報(bào)告熒光與內(nèi)參ROX熒光的比值，使定量更準(zhǔn)確。ROX染料的激發(fā)波長(zhǎng)為584nm，發(fā)射波長(zhǎng)為612nm。用ROX進(jìn)行校正后可以使實(shí)驗(yàn)誤差減小十倍左右。

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